信帆生物:Rt-PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備及與操作步驟
更新時(shí)間:2016-05-26 點(diǎn)擊次數(shù):1087次一、實(shí)驗(yàn)器具與材料:
1、移液槍:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、吸頭:1ml、200μl、20μl
3、勻漿管:5ml
4、吸頭臺(tái):放置1ml吸頭的一個(gè),放置20μl吸頭的一個(gè)
5、EP 管:1.5ml、0.2ml、100μl
6、試劑瓶:2個(gè)60ml的棕色試劑瓶(廣口,帶蓋)
1個(gè)125ml的白色試劑瓶(放無水乙醇)
7、量筒:50ml、250ml、500ml
8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml
9、試管架:5ml、 1.5ml、20μl
10、鹽水瓶:250ml、500ml各2個(gè)備用,一個(gè)裝無水乙醇,另一個(gè)裝DEPC水
11、鋁制飯盒:4個(gè)
12、塑料小飯盒:1個(gè)
13、大瓷缸:2個(gè)
14、錫泊紙:一卷
15、卷紙:2卷
16、三角燒瓶:帶蓋,稍大
二、實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備
1、塑料制品:(包括槍頭、EP管、勻漿管等)
先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中,將塑料制品逐個(gè)浸泡其中,其中小槍頭需要吸管打入DEPC水,過夜,然后高壓,再烤干備用,實(shí)驗(yàn)前將槍頭等放入吸頭臺(tái),再高壓一次(EP管)
2、玻璃制品:泡酸過夜,沖洗干凈,蒙錫紙烤干備用(DEPC水泡)(洗凈后先泡1‰DEPC過夜,再烤干)
3、勻漿器:(包括剪刀、鑷子)先洗凈后,再高壓(不需要泡DEPC)
三、試劑配制:
1、DEPC水:吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中靜置4小時(shí)備用。
2、75%乙醇:用無水乙醇+DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC 水需先高壓)
3、異丙醇:放入棕色瓶中
4、氯仿:放入棕色瓶中
5、瓊脂糖
四、幾種緩沖液的配制:
1、電泳緩沖液:
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5M EDTA 20ml? pH8.0
蒸溜水 1000ml
5×TBE (貯存液)
再將5×TBE稀釋10倍成0.5TBE就可以在電泳時(shí)使用(即工作液濃度),如取50ml貯存液+450ml水--→500ml工作緩沖液
2、上樣緩沖液:
0.25%溴酚藍(lán)
0.25%二甲苯青FF
30%甘油
6×緩沖液,4℃保存
五、瓊脂糖凝膠的配制:
1、 1.0%:
1.0g瓊脂糖+100ml電泳緩沖液,微波爐中火30秒至沸騰,熔化的瓊脂物冷卻至60℃時(shí)加入10mg/ml溴化乙錠 2.5μl,充分混勻,將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的膠膜中,在室溫下放置30-45min后現(xiàn)進(jìn)行電泳。
2、1.5%:
同上,將瓊脂糖的量改為1.5g
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