信帆生物：基因表達調(diào)控主要實驗技術(shù)
更新時間：2016-04-13 點擊次數(shù)：914次1 ChIP實驗
通過與染色質(zhì)片段共沉淀和PCR技術(shù)，在體內(nèi)檢測與特異蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA片段。將處于適當生長時期的活細胞用甲醛交聯(lián)后將細胞裂解, 染色體分離并打碎為一定大小的片段200bp-1000bp;然后用特異性抗體免疫沉淀目標蛋白與 DNA交聯(lián)的復合物, 對特定靶蛋白與DNA片段進行富集。采用低pH值條件反交聯(lián), DNA與蛋白質(zhì)之間的 Schiff鍵水解, 釋放DNA片段。通過對目標片段的純化與檢測,獲得DNA與蛋白質(zhì)相互作用的序列信息。
2 RIP實驗
RIP技術(shù)（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀），是研究細胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。運用針對目標蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復合物上的RNA進行分析；即用抗體或表位標記物捕獲細胞核內(nèi)或細胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白，防止非特異性的RNA的結(jié)合，免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來，結(jié)合的RNA序列通過microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或 高通量測序（RIP-Seq）方法來鑒定。是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點。
3 RNA pull-down實驗
使用體外轉(zhuǎn)錄法標記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復合物。該復合物可與鏈霉親和素標記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復合物洗脫后，通過western blot實驗檢測特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用。
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